Расшифровка производства мРНК: пошаговое руководство

Нуклеотидная последовательность мРНК транслируется в аминокислоты в соответствии с набором правил, называемых генетическим кодом. EF-Tu в своей GTP-связанной форме сопровождает аминоацил-тРНК в рибосому и дважды проверяет, что входящая тРНК идеально соответствует открытому кодону.

Поскольку многие кодоны могут указывать на одну и ту же аминокислоту, мРНК имеет избыточные стартовые кодоны, и многие из ее тРНК могут образовывать пары оснований с несколькими кодонами.

Структура мРНК

Молекула мРНК имеет характерную вторичную структуру, которая сворачивается в точно определенные трехмерные формы. Четыре коротких сегмента мРНК образуют клеверный лист, который комплементарно спаривается с комплементарными последовательностями в другой части молекулы мРНК, образуя L-образную структуру. Это связывание между мРНК и тРНК называется гибридизацией и имеет важное значение для синтеза белка.

Предшественник мРНК, который отделяется от ДНК-матрицы, представляет собой полинуклеотид с некодирующими областями (интронами) и кодирующими областями (экзонами). Эукариотическая мРНК проходит несколько стадий посттранскрипционной обработки, чтобы созреть для синтеза белка. Сначала некодирующие интроны удаляются комплексами РНК и белковых молекул, называемыми сплайсосомами. Затем к 5′-концу мРНК добавляется 7-метилгуанозиновый колпачок, а к 3′-концу — полиаденилированный хвост из многочисленных адениновых нуклеотидов, чтобы сделать ее более стабильной и предотвратить ее деградацию.

Кроме того, сигнальная последовательность в начале мРНК используется для установки правильной рамки считывания для синтеза белка. Наконец, мРНК распознается и транслируется тРНК в рибосоме. Во время трансляции тРНК функционируют как адаптеры для преобразования кодонов мРНК в аминокислотные последовательности, соответствующие определенным аминокислотным цепям в рибосоме. Затем аминоацил-тРНК-синтетазы присоединяют соответствующие аминокислоты к цепи пептидных связей. Полученные белки высвобождаются из рибосомы и транспортируются в другие клетки для дальнейших функций.

Транскрипция

Первым этапом процесса производства мРНК является транскрипция. Эта ферментативная реакция производит одноцепочечную молекулу РНК, комплементарную одной из двух матриц ДНК. Этот оптимизированный процесс последовательно давал 3-5 мг/мл полноразмерного лекарственного вещества мРНК с низким содержанием остаточной двухцепочечной ДНК.

После того, как РНК-полимераза заканчивает транскрипцию, ряд белков собирается на молекуле пре-мРНК. К ним относятся белки snRNP, которые удаляют шпильковые спирали, упаковывают мРНК для транспортировки в ядро ​​и другие комплексы белок-РНК, которые распознают определенные последовательности и отмечают границы экзон-экзон. Связывающий белок добавляет модифицированный гуанин к концу зарождающейся РНК. Другой белок (фосфатаза) удаляет одну из фосфатных групп, а третий (метилтрансфераза) добавляет метильную группу к гуанину, образуя кэпированную мРНК.

Эта кэпированная мРНК экспортируется из ядра с помощью комплекса ядерной поры в цитозоль клетки у эукариот. Этот шаг облегчается ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами, которые прикрепляют правильную аминокислоту к каждой нуклеотидной последовательности в мРНК, и белками, которые направляют ее через комплекс пор. Наконец, определенный фактор сплайсинга, зависящий от мРНК, называемый EF-Tu, различает различные молекулы аминоацил-тРНК. Он направляет в рибосому только те, у которых правильная кодирующая последовательность.

Перевод

Ваши клетки производят белки каждую секунду дня, и каждому белку требуется цепочка аминокислот, соединенных правильным образом. Для этого мРНК сначала должна быть переведена в полипептидную цепь двумя типами молекул РНК: транспортной РНК (тРНК), которая считывает генетическую информацию, содержащуюся в последовательности нуклеотидных триплетов мРНК («кодонов»), и переносит ее в рибосомальную рРНК, центральный компонент рибосомного механизма производства белков.

При трансляции последовательность мРНК начинается в одном из трех возможных мест на рибосоме, каждое из которых идентифицируется кодоном (триплетом нуклеотидов), который кодирует определенную аминокислоту. Во время трансляции тРНК, несущая первый кодон, связывается с рибосомальной рРНК на сайте P. В результате к рибосоме добавляется молекула метионина, а новый кодон экспонируется в другом слоте рибосомальной рРНК, известном как сайт A.

Фактор удлинения, связанный с GTP (EF-Tu), сопровождает аминоацил-тРНК к сайту A, который сопоставляет свой антикодон с соответствующей аминокислотой в цикле связывания, гидролиза GTP и диссоциации. Когда это происходит, комплекс тРНК-аминоацил-тРНК запускает дополнительные конформационные изменения в рибосоме, и сайт A готов принять следующую входящую аминокислоту.

Сборка

После транскрипции мРНК ее необходимо собрать в сложную молекулярную структуру, что позволяет производить белок. На этом этапе инициирующая тРНК (несущая метионин) связывается с 5′ кэпом мРНК и сканирует от начала кодирующей последовательности до 3′ конца, ища правильный стартовый кодон. После нахождения большая рибосомная субъединица присоединяется к комплексу для завершения сборки. Затем этот комплекс готов к трансляции.

Этот процесс облегчается особенностью мРНК, называемой последовательностью Шайна-Дальгарно, которая отмечает начальную позицию каждой кодирующей последовательности. Эта последовательность гарантирует, что рибосома стартует в правильном месте мРНК и не застрянет ни на одном участке, что остановило бы синтез белка.

В процессе нисходящего потока мРНК очищается для удаления солей, аналогов кэпа, NTP, белков, остаточной плазмидной ДНК и dsRNA. Это достигается с помощью серии единичных операций, объединенных двумя тангенциальными проточными фильтрациями и диафильтрацией (UFDF). Это обеспечивает удаление нежелательных примесей, сохраняя при этом чистоту продукта и приемлемые условия загрузки хроматографии.